TUNEL細胞凋亡檢測服務

　　TUNEL細胞凋亡檢測服務實驗原理和方法原理：細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30%的染色體DNA在Ca2和Mg？依賴的核酸內切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180~200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列DNA的37-0H末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的37-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有37-OH形成，很少能夠被染色。

        細胞凋亡中染色體DNA 的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb 的大片段。然后大約30 %的染色體DNA 在Ca2+和 Mg2+依賴的核酸內切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180~200bp核小體DNA多聚體。

　　DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列DNA的 3'-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL)。

　　由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA 的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進行缺口翻譯（nick translation)，使低分子量的DNA標記或染色，然后分析凋亡細胞。

　　TUNEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法,對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋廣測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。

2.包埋或者切片后，根據客戶所測指標，選取合適的一抗.二抗進行制片

3.（可選）根據上述所做好的切片進行拍片

4.（可選）針對做好的玻片進行分析，分析時選取較好的區域，分析三個視野

5.提供實驗報告：包括詳細的實驗方法及實驗結果的相關圖表

技術服務內容

　　客戶須知

實驗周期

       TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細胞凋亡檢測是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況，其原理是生物素biotinylate標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的鏈霉親和素streptavidin特異性結合，后者又與POD底物H2O2、二氨基聯苯胺（DAB）產生深棕色反應，特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應用于抗腫瘤藥的藥效評價，以及通過雙色法確定細胞死亡類型和分化階段.

TUNEL細胞凋亡檢測服務實驗方法

TUNEL 檢測對于貼壁細胞或細胞涂片

b.如果細胞貼得不牢，可以干燥樣品使細胞貼得更牢。

c.用4%多聚甲醛或碧云天生產的免疫染色固定液（P0098）固定細胞30-60分鐘。

d.用PBS或HBSS洗滌一次。

e.加入含0.1%TritonX-100的PBS，冰浴孵育2分鐘。

f.轉步驟5。

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